热心网友的回答：
你的目的基因两端加了酶切位点么？或者目的基因转录序列的外侧有没有酶切位点？有的话双酶切再连线。没有的话建议你设计带酶切位点的接头，然后再连到t载体上去。
这样。你先把含t载体的菌摇起来，提质粒，双酶切，割胶**酶切片段（小的那一段，就是你要的基因）。2301载体你看看有没有那两个酶切位点，同尾酶也可以，双酶切，**切开的载体。
然后把载体和基因片段连线，转化感受态细菌，挑平板，就行了。不要用菌液，要用提出的质粒！酶切体系你购买酶的时候会告诉你的。
浙大阿米巴的回答：
请说清楚，不是每个人都在从事和你一样的工作。
构建质粒表达载体为什么要先连t载再连pmv261?
的回答：
先连线t载体是为了提高转化效率
一般来说市面上**的t载体都进行了优化，容易连线片段（也就是效率较高），因此构建表达载体时有时会先连线t载体。同时t载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。更重要的是，t载体往往设计了蓝白斑筛选的功能，插入片段的载体会呈现白色，这样也容易区分验证，不用每个单菌落都拿去做colony pcr或提质粒酶切验证。
当然也不是绝对的，我们实验室就经常直接把片段酶切后连线表达载体，不经过t载体这一步，其实影响并不大。如果你的情况比较特殊（比如片段较大，或是对应的表达载体拷贝数较低等），可以考虑连线t载体，不然的话不是非常必要。
我有一个基因片段老是正向连线到pmd18-t载体上，我现在想要它反向连线上去，有什么好的方法吗？
热心网友的回答：
在插入序列2端用pcr连线上不同的酶切位点（和载体的位置相对），用酶处理pcr产物和载体，然后再连线就可以了。
热心网友的回答：
要么你像楼上说的那样，做定向克隆；我想你的本意就是要避免换个引物再亚克隆一次，所以你
内只能多筛一些克隆容，可以用 m13f+你特异基因的f引物 批量做菌落pcr验证（或m13r+特异基因的r），扩出条带就是反向插入了。如果p了上百个克隆还 没有，劝你放弃吧，还是定向克隆吧。
为什么要进行亚克隆？一个基因已经克隆到t载体上了，想表达它，为什么还要进行亚克隆，连到pet40b呢
热心网友的回答：
t载体一般是克隆载体，需要克隆到表达载体，用相应的启动子启动表达
的回答：
t载体不是表达载体。
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最小阻值则要可通过的最大电流，最大阻值则要最大电压，那么点值电阻两端电压就要最小。最大电压则为电压表的最大电压，电源电压减最大电压就是定值电阻两端最小电压，就可求出此时电流。这就是最大电阻 连入电路的话，你要採用极限法。初中的话应该是和小灯泡或者一个用电器串联的，你可以依据灯泡的最大流入电流来算的。...
