人们对运动丘脑基底节接收区（BGMT）的功能作用仍然知之甚少。因此，为了研究基底节通过黑质网状旁（SNr）的输出和向BGMT的投射是如何控制运动行为的，我们在小鼠执行二选一的舔食任务时，在运动准备和开始期间单侧抑制或兴奋基底节输出神经元及其向BGMT的投射。通过将携带抑制性视蛋白 DIO-ARCH3 的病毒载体植入 VGAT-cre 小鼠的窦房结神经元，我们抑制了窦房结神经元在反应窗口开始前 0.5 秒的活性。光激活SNr中的ARCH3可抑制SNr的活动，并使舔舐反应偏向于刺激半球对侧的舔嘴。在另一组小鼠中，我们使用 ChR2 蛋白素的快速变体（DIO-hChR2-E123A/T159C）来激发 SNr 的活动，无论试验方向如何，这种变体都能抑制舔舐活动。然而，从SNr到BGMT的神经投射兴奋末端会使舔食反应偏向刺激同侧的舔嘴。这些结果表明，在有行为的小鼠中，SNr 在指导运动准备和启动方面发挥了作用，这广泛支持了基底神经节的经典模型，即基底神经节输出活动的减少通过丘脑-皮层通路促进了自主运动。
一、研究简介
基底神经节（BG）被认为通过抑制和促进选定的运动程序来完成和强化目标导向行为，从而影响对运动的控制。我们对基底神经节在运动控制中的作用的长期理解表明，基底神经节的输出核对丘脑和脑干的运动区域提供强直性抑制，以抑制不需要的运动；因此，抑制输出的暂停将促进运动的启动。为支持这一一般基底节功能模型，已发现对基底节直接通路的光遗传学调节有利于运动，可导致啮齿类动物主要基底节输出核 SNr 的抑制减少，并解除对下游目标的抑制。此外，在大鼠执行听觉诱导的 “走-停 ”任务时，SNr 活动的停顿会先于定向运动的启动。最近的研究表明，降序运动皮层投射控制着成年小鼠的侧向（左侧与右侧）舔食。从大脑皮层到丘脑（包括小脑和基底节接收区域）的环路也被认为控制了侧化舔的准备和启动，例如在延迟舔食任务中，从运动丘脑记录到的神经活动显示在舔食启动前出现了斜坡，抑制丘脑可将舔食表现降低到偶然水平。基底神经节的定位是通过基底神经节输出核（即黑质网状核（SNr）和苍白球内核（GPi））的抑制性投射来影响皮质-丘脑环路和定向舔舐行为。本研究的目的是探讨基底节的输出活动如何影响目标定向行为的启动和抑制，以及运动丘脑的输出投射在其中发挥了何种作用。为了实现这一目标，我们训练小鼠完成一项双向选择的舔食任务，即小鼠必须在左侧或右侧空气喷出后分别舔食左侧或右侧位置的舔食口。为了进一步分析 BG 输出对运动准备和抑制的认知控制的贡献，我们训练同样的小鼠执行该任务的两个变体：首先让小鼠在反应窗口之前舔食并预期奖励的提供（“预期 ”任务变体），然后要求小鼠在反应窗口开始之前主动暂停舔食（“暂停 ”任务变体）。通过训练小鼠一个接一个地完成这些任务变体，我们能够分析基底神经节对启动或抑制预期动作的贡献，以及对奖励选择准备和启动的控制。利用光遗传学方法抑制单侧的SNr神经元，我们发现，抑制基底节的抑制性输出会引发舔舐抑制侧的对侧，而与奖励的舔舐方向无关。与此相反，兴奋神经元向运动丘脑的投射并抑制丘脑的活动会抑制对侧舔舐并使舔舐偏向同侧方向。无论舔舐方向如何，直接兴奋神经元都会完全抑制舔舐。这些结果表明，在感觉引导的运动行为中，基底节通过SNr向运动丘脑输出的信号对运动准备和启动具有强大的单侧控制作用。
二、研究方法
2.1 动物
光遗传刺激和电生理实验使用的是实验开始时年龄为 6-12 个月的雌雄 Vgat-IRES-Cre 小鼠（Slc32a1）。小鼠的光照周期为 12 小时：12 小时，所有实验和行为训练都在光照周期的黑暗部分进行。接受行为训练的小鼠可自由进食，并在处理、训练和实验测试前至少 3 天开始每周 6 天限制饮水 1-1.5 毫升/天。每周的第 7 天，小鼠可以自由饮水。在行为训练和测试期间，给小鼠饮用含 0.1% 葡萄酷爱粉的 10% 蔗糖溶液。测试期间测量小鼠的液体消耗量，并补充水以达到每天 1-1.5 毫升的量。所有实验程序均经过埃默里大学动物护理和使用委员会批准。
2.2 手术
病毒载体注射和光纤放置。注射光遗传 AAV 向量时，用异氟烷麻醉小鼠（诱导浓度为 3-4%，维持浓度为 1-2%），并将其头部固定在立体定向架上（Kopf）。在右侧SNr上方单侧开颅。用纳米注射器（Nanoject II）将 200nL 的 AAV5-EF1a-DIO-eARCH3.0-eYFP （ARCH；n = 5，3 雄性）或 200nL 的 AAV5-EF1a-DIO-hChR2(E123T/T159C-EYFP （ChR2(ET/TC) 或 ChR2；n = 4，2 雄性）以 0. 46nl/s的速度向SNr注射，目标坐标为（距Bregma mm）：AP-3.2，ML 1.6，DV-4.2）。然后将 200 微米、0.22NA 光导纤维（Thor Labs）和 1.25 毫米钢套植入体侧 SNr 和丘脑腹内侧（AP -1.5, ML 0.9, DV -4.0），用于体侧 SNr 兴奋和 SNr-BGMT 末端兴奋。手术植入后，小鼠被关在单人笼中。急性电极/光电记录。为了记录和/或光遗传学操作SNr或下游投射目标的神经群，在这些区域的目标部位上方进行开颅手术，并保持硬脑膜完整。在开颅手术周围粘上直径 4 毫米、高 1 毫米的塑料管，并在该区域填充可拆卸的弹性体，以便在未来的实验中接触组织。
2.3 行为任务
动物训练方案和行为范式改编自之前报道的程序。行为范式如图 1A 所示。左侧和右侧的吹气/舔食试验是伪随机选择的，因此右侧/左侧试验的概率会根据左侧/右侧奖励试验的比例进行调整（例如，对于由 8 次正确的右侧试验和 4 次正确的左侧试验组成的当前会话的试验历史，下一次试验为左侧试验的概率设定为右侧奖励/总奖励 = 66%）。每次试验由 3 个不连续的时间段组成：“前刺激 ”时间段、“感觉 ”时间段（小鼠接受向左或向右吹气 1-1.5 秒钟）和 5 秒钟的 “反应 ”时间段（小鼠舔向左或向右的喷气口，表示它们认为哪个喷气口会得到奖励，并吃掉奖励）。各次试验之间的间隔时间各不相同。在感觉期，轻微的非厌恶性气泡刺激通过直径为 2 毫米的钢管射向胡须。钢管与小鼠中心成 15 度角，以便将气流刺激隔离到胡须上，同时避开小鼠的面部。在训练过程中，刺激持续时间为 1-1.5 秒，但在扣留任务的光遗传学实验中，采样时间保持不变，为 1 秒。
图 1. 小鼠学习完成二选一舔舐任务中的预期型和隐忍型变体。A. 备选舔舐任务示意图。每次试验开始前都有一个持续 2-3 秒的预试验期，小鼠不能舔任何一个喷嘴。在取样期间，小鼠的左胡须或右胡须上会有一个气泡，气泡会持续 1-1.5 秒。如果小鼠的决定舔食是正确的（舔向左侧喷口则为左吹气，舔向右侧喷口则为右吹气），则小鼠会从正确的喷口获得液体奖励。如果小鼠在反应时间内（2-5 秒）没有舔出液体，或者舔出了错误的喷口，则不会获得奖励。B. 随后对小鼠进行两种不同的舔食任务训练。首先，对小鼠进行 “预期 ”变体训练，即允许小鼠在 “吹气 ”过程中舔向任何一个喷口，以预期反应期和可能的奖励。在小鼠学会这项任务后，再对它们进行扣留变异任务训练，即在吹气过程中小鼠必须抑制舔食行为。C. 小鼠在完成预期变体任务时正确试验的平均舔舐频率曲线（N = 12 只小鼠）。左侧。左侧试验（n = 1151 次试验）中，小鼠在气吹开始后开始出现预期舔食（深蓝色），气吹偏移后的第一次舔食被算作决策舔食（中间蓝色）。取回舔食（浅蓝色）是指小鼠在正确舔食后取回蔗糖奖励。右图 格式与左侧试验相同，但显示的是右侧试验（n = 1098）。预期舔食、决策舔食和取回舔食分别以深红色、中间红色和浅红色表示。D. 小鼠执行扣留变体任务时正确试验的平均舔舐频率轨迹（N = 8 只小鼠）。左侧。在左侧试验（n = 397 次试验）中，小鼠在气吹过程中成功地抑制了舔舐活动，气吹偏移后的第一次舔舐再次被算作决策舔（中蓝色）。取回舔食（浅蓝色）是指小鼠在正确舔食后取回蔗糖奖励。右图。与左侧相同，但现在是右侧舔食试验（n = 403 次试验）。
2.4 光遗传刺激
每次训练前后，使用光功率计和传感器（PM100D 和 S121C，ThorLabs）测定光源（LED 或激光）的输出强度。在 SNr 抑制实验中，我们使用了 593nm 黄色激光器，该激光器经过准直处理并与 200 微米、0.22 NA 的贴片电缆耦合，可从光纤端输出 8-12mW 的功率。对于体部 SNr 激发，我们使用了 470nm LED（Doric Lenses），耦合到相同的跳线上，光纤端输出功率在 1-3mW 之间。最后，对于 SNr-BGMT 末端激励，我们使用了 470nm 的蓝色激光器，并使用了相同的贴片电缆，光纤顶端的输出功率在 8-12mW 之间。光刺激试验与对照试验随机混合，光照射试验的总比例为 25-50%。此外，所有光刺激试验都以固定的 1 秒空气吹气持续时间进行，以避免刺激与预期舔食时间之间的不一致关系。
2.5 电生理学
手术准备期间，在未来的右侧 SNr/BGMT 记录点（-4 至 1 毫米 AP，0.5 至 2.5 毫米 ML）上进行开颅手术，并用 Kwik-cast (WPI Inc.) 覆盖。硬脑膜保持完整。在对侧感觉皮层上放置一枚不锈钢参考颅骨螺钉（#19010-10，Fine Science Tools）。在螺钉和金针之间焊接了一根直径为 0.01 英寸的钢丝，以便在记录期间连接到采集系统。小鼠至少有 3 天的恢复时间。恢复后，小鼠适应头部固定，并开始记录（每天一次，每次 2 小时）。在第一次头部固定过程中，小鼠没有表现出明显的应激迹象，看起来很放松。在记录过程中，小鼠保持随机间隔奖励范式，每隔 30-60 秒通过右侧或左侧舔嘴向小鼠提供蔗糖奖励，以鼓励小鼠在记录过程中保持安静清醒。实验开始时，取下开颅手术上的 Kwik-cast 盖。将由 50-100 微米光导纤维（ThorLabs）组成的定制光导管放入 SNr 或 BGMT，光导管连接在微电极（FHC）上方 200-300 微米处。原始信号（0.1-10 kHz 带通滤波）以 20 kHz 频率采集、放大和数字化（RHD2132 头台，Intan Technologies）并保存（RHD2000 评估系统/接口软件，英腾科技）。一旦在SNr或BGMT中检测到单元活动，就会使用黄色（593 nm）或蓝色（473 nm）激光进行光刺激，每隔10秒发出1或2秒的连续脉冲，分别刺激表达ARCH3或ChR2的神经元。在某些记录中，光导纤维被放置在SNr中，并在BGMT中放下一个单独的电极，以记录刺激部位下游的活动。每次记录后，用 Kwik-cast 覆盖开颅，最后一次记录后，用 PBS 灌注小鼠，然后用 4% 多聚甲醛和 15% 蔗糖灌注。然后取出大脑并转移到 4% 多聚甲醛/30% 蔗糖溶液中，以便随后进行组织学处理。
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2.6 数据分析
行为和电生理数据分析在 MATLAB（MathWorks）中进行。分析只包括基线表现高于 60% 的行为试验。如果小鼠在试验开始（气泡开始）前舔舐的时间小于 1 秒，则会被捕获并发送到试验间延迟。这种试验很少见（在受过训练的小鼠中小于 2%，因此不在分析之列）。舔食数据经过预处理，以去除 “伪舔食”（通常分别由电噪声和爪触引起的短于 10 毫秒的喷口接触和长于 200 毫秒的接触）。在随后的分析中，决定舔（反应期间的第一次舔）被归类为伪舔的试验被删除。为了计算各种行为和实验条件下的平均舔舐频率，我们标记了舔舐接触的起始点，并将每次试验中的舔舐接触以 50 毫秒为一档求和，然后除以一档的持续时间长度。使用引导法确定每种光遗传刺激条件下成绩变化的显著性，以考虑小鼠、疗程和试验之间的变异性。我们针对光遗传刺激引起的表现变化是正常行为变异所致这一零假设进行了测试。在每一轮引导中，我们用重新取样的数据集替换原始数据集，其中我们从以下方面进行了替换取样：1）动物；2）每只动物进行的会话；3）每个会话中的试验。然后，我们计算重新取样数据集的性能变化。重复这一过程 10,000 次后，我们得出了反映行为变异性的成绩变化分布。观察到的表现变化的 P 值计算为自引导产生不一致的表现变化的次数分数（例如，如果在光遗传刺激过程中观察到表现下降，则 P 值为自引导过程中观察到表现上升的次数分数，单尾检验）。除非另有说明，误差条代表自引导产生的 +/- SEM。
三、研究结果
3.1 小鼠学习完成 “预期 ”和 “搁置 ”变体的二选一舔舐任务。
为了了解基底神经节的输出如何影响定向舔舐行为，我们采用了一种二选一的行为任务。为了进一步分析基底神经节输出对运动准备和抑制的认知控制的贡献，我们训练同组小鼠完成该任务的两种变体：第一种变体是让小鼠在反应窗口前舔食并期待奖励的提供；第二种变体是要求小鼠在反应期开始前主动暂停舔食（图 1B）。通过训练相同的小鼠依次完成这些任务变体，我们能够分析基底神经节对舔食动作的预期和启动（预期任务）以及对动作准备和抑制（抑制任务）的控制的贡献。
3.2 单侧SNr失活偏向于对侧舔食行为。
我们开始评估基底神经节输出在替代选择舔食任务的预期变体中的作用，方法是通过激活黑质 ARCH3 快速、可逆地光遗传失活 SNr（图 2A）。在处于静止状态的清醒小鼠中，对表达 ARCH3 的黑质神经元进行黄色（593nm）光刺激，可在刺激持续时间内取消几乎所有的发射活动（平均发射率基线为 17.2Hz vs. ARCH 抑制为 2.61Hz，n = 10 个单个单元，图 2BC）。刺激消失后，发射率迅速恢复到基线水平。在行为小鼠中，我们对右半球的SNr进行了光遗传学操作（图2D）。为了研究 SNr 在预期舔舐活动中的作用，我们在气吹偏移前 0.5 秒抑制 SNr，并在任务的 “预期 ”变体反应期后 0.5 秒继续抑制 SNr。在此期间抑制右侧嗅觉神经元会使舔舐活动偏向左侧（被抑制的嗅觉神经元的对侧）（图 2EF）。在右侧气吹试验中，左侧决定舔的次数显著增加，右侧试验的总体成功率下降（图 2H）。此外，右侧气吹试验成功率的降低是由于无反应试验的增加（图 2H，P<0.001）。与此相反，左侧气泡试验的成功率增加与错误决定向右舔的次数减少有关（5 只小鼠，36 次，P<0.001（左侧），P<0.001（右侧），bootstrap，图 2H）。重要的是，在有或没有抑制 SNr 的试验中，成功的试验显示了相同的预期舔食量和时间，以及相同的消耗性舔食率（图 2F）。这表明，右侧SNr抑制时决策向左侧偏移不是因为向对侧移动的速度减慢，而是决策过程中的分类变化。在注射不含 ARCH3 的 EYFP 病毒的对照组小鼠（n = 2）中，光刺激对舔食行为或任务表现没有影响（2 只小鼠，11 次，图 2IJ）。
图 2. 单侧 SNr 失活导致对侧舔舐行为偏向 A. 光遗传载体注射和光导纤维靶向示意图。将 Cre 依赖性 AAV2-DIO-ARCH3-EYFP 注入 VGAT-cre 转基因小鼠的右侧 SNr，并将连接微电极的光导纤维放入 SNr。B. 表达 ARCH3 的 SNr 神经元的单单位记录示例。593nm 激光刺激会在光脉冲持续时间内抑制发射活动，光刺激偏移后发射活动会迅速恢复。C. 与刺激开始时一致的 10 次刺激试验，显示 ARCH3 对 SNr 活动抑制的一致性。D. 插图显示了小鼠相对于位于小鼠前方的左右舔舐喷口的方位，以及通过植入 SNr 上的光纤进行的光遗传照明。E. 行为示例，显示左右光遗传试验和基线试验中的舔食活动。试验按光遗传刺激条件（刺激试验在上，基线试验在下）和气泡呈现的长度排列。蓝色和红色水平线表示在取样期间出现的气泡，黄线表示光遗传 SNr 抑制期间。在本例中，右侧 SNr 的光遗传抑制破坏了小鼠右侧（同侧）的舔食行为，从而使小鼠偏向于舔食左侧（对侧）的喷口。F. 有（彩色线）和没有（灰色线）光遗传学右侧 SNr 抑制的正确试验的平均舔食频率轨迹。在左侧试验（n = 300 opto，247 baseline，左侧）和右侧试验（n = 185 opto，301 baseline，右侧）中，小鼠对正确喷口的预期舔舐活动一直持续到反应期开始。预测性舔食用最深的颜色线表示，其次是决策性舔食（中间色）和检索性舔食（最浅色线）。G. 单侧 SNr 光遗传抑制在预期任务中的行为效应。H. 左侧（蓝色）和右侧（红色）、关闭（浅色）和开启（深色）刺激之间的表现变化。条形高度代表所有环节（n = 35 个环节）的平均值，形状代表每只小鼠（5 只）的平均值。误差条代表 SEM（bootstrap，10000 次迭代）和基于 bootstrap 的 p 值（见方法，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05）。左图 B 与交错基线试验（浅蓝色/红色列）相比，右侧SNr抑制时的舔食表现（深蓝色/红色列）显著提高了左侧试验的正确率（p<0.001），显著降低了右侧试验的正确率（35次，5只小鼠）。中间。光遗传抑制右侧SNr导致右侧错误方向失败试验（在右侧试验中错误地舔左侧）的百分比显著增加（P<0.001）。右。对于左侧舔舐试验，SNr 抑制显著减少了无反应试验的次数（P< I. 注射 cre 依赖性 EYFP 的对照组小鼠（n = 2）的光遗传刺激行为效应。J. 与 H 相同，但为对照刺激。正确试验百分比（左）、错误方向试验百分比（中）或无反应试验百分比（右）均无明显变化。
3.3 单侧SNr抑制会减少对对侧方向的反应时间。
为了验证SNr光遗传抑制会干扰小鼠抑制不想要的预期动作的能力这一假设，我们在进一步训练小鼠完成 “抑制 ”变体任务后，在气吹刺激的后半段激活了同一只小鼠的ARCH。一部分小鼠（5 只小鼠中的 3 只）能够学会这项变体任务。在达到 60% 的成绩后，我们再次测试了在 1 秒气吹偏移前 0.5 秒开始的光遗传操作的效果。这种操作再次使试验的执行侧向化，但与 “预期 ”任务相比，具有更多特征（图 3）。右侧气吹试验再次导致错误方向决策舔的比例显著增加（图 3E，P<0.01，bootstrap）。然而，在光遗传 SNr 抑制的右侧气吹试验中，扣留版任务的总体正确率略有提高（3 只小鼠，17 次试验，P=0.041，自引导），与预期任务中观察到的变化相反。通过进一步检查失败类型的分类（图 3E），我们发现早期舔食导致的失败减少了（P<0.001，bootstrap），这表明抑制 SNr 时，在 “扣留 ”任务中抑制预期舔食的成功率更高。相反，左侧气吹试验与此类早期舔食的显著增加有关（P<0.01，bootstrap）。这支持了一个假设，即抑制 SNr 输出不仅会直接影响舔舐的方向，还会削弱向刺激的对侧方向暂缓舔舐的能力，并促进向同侧方向暂缓舔舐。在光遗传刺激下，正确试验（图 3C）的平均舔舐频率与对照试验相似，这表明舔舐过程本身并没有中断。然而，与基线左侧和右侧试验相比，成功试验确实显示出舔左侧的反应时间更短，而舔右侧的反应时间更长（图 3 HI，P<0.01（左侧），P<0.01（右侧），bootstrap）。这表明，当小鼠能够在光遗传刺激过程中停止舔食时，抑制基底神经节的输出会使运动准备或运动准备出现偏差，从而使小鼠能够更快地对对侧喷口做出反应，而对同侧方向的反应则更慢。
A. 图解显示小鼠的方位，右侧和左侧舔食喷口位于小鼠前方，光遗传照明通过植入在SNr上的光纤进行。B. 行为过程示例，显示左右光遗传和基线试验的逐次舔食活动（不包括早期舔食试验）。试验按光遗传刺激条件排列（刺激试验在上，基线在下）。蓝色和红色横线表示在采样期间出现的气泡，黄色横线表示光遗传 SNr 抑制期间。在本例中，右侧 SNr 的光遗传抑制使左侧（对侧）试验的舔食开始时间更接近反应窗口的开始时间，这似乎略微延迟了右侧（同侧）的舔食行为。C. 有（彩色线）和没有（灰色线）光遗传右侧SNr抑制的正确试验的平均舔舐频率轨迹。在左侧试验（n = 71 opto，140 基线，左侧）和右侧试验（n = 89 opto，127 基线，右侧）中，与基线舔舐决策相比，小鼠在左侧试验中表现出更快的决策舔舐活动。深色阴影线表示决策舔舐活动，浅色阴影线表示恢复舔舐活动。G. 单侧 SNr 光遗传抑制在扣留任务中的行为效应。H. 左侧（蓝色）和右侧（红色）、关闭（浅色）和开启（深色）刺激之间的表现变化。条形图高度代表所有环节（n = 16 个环节）的平均值，形状代表每只小鼠（3 只）的平均值。误差条代表 SEM（bootstrap，10000 次迭代）和基于 bootstrap 的 p 值（见方法，**p<0.01，*p<0.05）。左图 与基线试验（浅蓝色/红色列）相比，右侧 SNr 抑制期间的舔舐表现（深蓝色/红色列）使右侧试验的正确率略有显著提高（p=0.0418，16 次训练，3 只小鼠）。左中。右侧 SNr 的光遗传抑制导致左侧早期舔食失败试验的百分比显著增加（P=0.016），而右侧早期舔食试验的百分比显著下降（P<0.01）。右中。光遗传抑制SNr增加了错误方向右侧试验的百分比（P<0.01）。右图。右侧 SNr 抑制对左侧（P=0.23）和右侧（P=0.048）无反应试验的百分比分别产生了轻微的下降趋势和略微显著的下降。F. 注射 cre 依赖性 EYFP 的对照小鼠的光遗传刺激行为效应。G. 与 H 相同，但为对照刺激（n = 2 只小鼠，7 次）。正确（左）、早期舔（左中）、方向错误（右中）或无反应试验（右）的表现均无明显变化。H. 在光遗传 SNr 抑制和未抑制的情况下，左侧和右侧试验的平均反应时间。在 SNr 抑制试验期间，左侧试验的反应时间明显减少（P<0.01），右侧试验的反应时间明显增加（0.01）。I. 累积分布图显示左侧（左）和右侧（右）舔食试验反应时间分布的变化。光遗传刺激试验为蓝色/红色，基线分布为灰色。左侧试验（左）的反应时间分布向较短反应时间方向移动，右侧试验（右）的反应时间分布向较长反应时间方向移动。
3.4 单侧兴奋SNr会影响对侧和同侧的舔食活动。
由于抑制基底节输出会导致运动开始和准备的对侧偏向，基底节速率编码的经典模型预测，增加基底节输出会对舔舐活动产生相反的影响，即减少向刺激对侧方向舔舐的正确决定。为了验证这一预测，我们使用神经激活剂 ChR2(ET/TC)来增加基底节的输出活动（图 4A）。在清醒的小鼠中，使用 1 秒钟的连续脉冲蓝光（473 nm）刺激 SNr，可使本已高度活跃的 SNr 在刺激持续时间内的发射率增加到基线的约两倍（基线时的平均发射率 = 13.9Hz vs. opto = 49.9Hz，n = 8 个单个单元，图 4BC）。在执行预期变体行为任务的小鼠中（n = 4 只小鼠，16 次训练，图 4D），当预期舔食行为在吹气的前 0.5 秒开始后，刺激右侧 SNr 会在刺激持续时间内抑制左右侧的舔食活动（图 4EF）。光遗传扰动消失后，小鼠通常会恢复舔向正确的喷口（图 4EF），这表明它们在运动抑制期记住了气吹的方向。这种表现下降既是舔错喷口方向的结果（图 4H，P<0.01（左），P<0.001（右），自引导），也不是在反应期间舔的（图 4H，P<0.05（右），自引导），表明在运动抑制期间舔方向的神经表征部分丧失。在注射了不含 ChR2 的 EYFP 病毒的对照组小鼠（n = 2）中，蓝光刺激对舔舐行为或任务表现没有影响（图 4IJ）。与经典速率模型预测的结果相比，这些结果给出了一个更复杂的双向运动控制的图景，即SNr抑制或兴奋。尤其引人注目的是，在 ChR2 诱导 SNr 速率增加时，双侧舔舐完全停止，这与 ARCH 抑制的侧向效应明显不同。
图 4. 单侧兴奋SNr会损害对侧和同侧的舔舐活动 A. 光遗传载体注射和光导纤维靶向示意图。将 Cre 依赖性 AAV2-DIOhChR2(E123T/T159C)-EYFP 注入 VGAT-cre 转基因小鼠的右侧 SNr，并将连接微电极的光导纤维放入 SNr。B. 表达 ChR2(ET/TC)的 SNr 神经元的多单元记录示例。473nm 激光刺激会在光脉冲持续时间内增加发射活动，光刺激偏移后发射活动会迅速恢复。C. 与刺激开始时一致的 10 次刺激试验，显示 SNr 活动在各次试验中的兴奋情况（从 B 所示记录中分离出的单个单元）。在 ChR2 兴奋期间，平均发射率从 13.9Hz 增加到 49.9Hz（n=10 个神经元）。在光遗传刺激过程中，示例神经元的发射率增加了 14.4Hz 与 46.3Hz。D. 插图显示了小鼠相对于位于小鼠前方的左右舔舐喷口的方位，以及通过植入 SNr 上的光纤进行的光遗传照明。E. 行为示例，显示左右光遗传试验和基线试验中的舔食活动。试验按光遗传刺激条件（刺激试验在上，基线试验在下）和气泡呈现的长度排列。蓝色和红色水平线表示样本期间气垫的呈现，浅蓝色线表示光遗传 SNr 激发期间。在本例中，右侧 SNr 的光遗传激发中断了右侧（同侧）和左侧（对侧）光遗传刺激方向上的舔舐行为，但在光抵消后舔舐行为又会恢复。F. 有（彩色线）和没有（灰色线）光遗传右侧SNr兴奋的正确试验的平均舔舐频率轨迹。在左侧试验（n = 96 opto，168 baseline，左侧）和右侧试验（n = 103 opto，153 baseline，右侧）中，小鼠表现出对正确喷口的预期舔舐活动，这种活动在基线舔舐的反应期开始前一直在增加，但在光遗传试验中，这种活动在光刺激开始后被抑制。预期舔用最深的颜色线表示，其次是决策舔（中间色）和检索舔（最浅色）。G. 单侧 SNr 光遗传激发在预期任务中的行为效应。H. 左侧（蓝色）和右侧（红色）、关闭（浅色）和开启（深色）刺激之间的表现变化。条形高度代表所有环节（n = 16 个环节）的平均值，形状代表每只小鼠（4 只）的平均值。误差条代表 SEM（bootstrap，10000 次迭代）和基于 bootstrap 的 p 值（见方法，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05）。左图 与基线试验（浅蓝色/红色列）相比，右侧SNr兴奋时的舔舐表现（深蓝色/红色列）显著降低了左右试验的正确率（p<0.01，16次训练，4只小鼠）。中间。右侧SNr的光遗传激发导致左侧（P<0.01）和右侧（P<0.001）错误方向失败率显著增加。右侧 在左侧舔食试验中，SNr兴奋显示出左侧无反应试验百分比增加的趋势（P=0.094），而在右侧舔食试验中，无反应试验百分比略有显著增加（P<0.014）。I. 注射 Cre 依赖性 EYFP 的对照小鼠的光遗传刺激行为效应。J. 与 H 相同，但为对照刺激（n = 2 只小鼠，8 次）。正确率试验（左）、错误方向试验（中）或无反应试验（右）的表现均无明显变化。
四、研究讨论
我们的研究结果表明，基底神经节输出的兴奋和抑制通过信号发生器对舔舐方向的认知控制产生侧向和对立的影响。SNr向运动丘脑和上丘脑发出抑制性投射，这两个结构与小鼠的舔食控制直接相关。我们的研究结果揭示了丘脑上升通路的独特作用，即当下降通路参与时，会出现双侧舔抑制，而 BGMT 通路则会产生不同的侧向效应。我们的行为任务训练的一个重要特点是使用了两种不同的任务变体，它们需要不同的认知要求（图1）。光遗传激发SNr单侧抑制了对两个舔嘴的预期舔食，而激发BGMT中的SNr末梢则抑制了对侧舔食。在小鼠执行类似的定向舔食任务时，通过光遗传学或麝香草酚失活来抑制VM丘脑或前侧运动皮层（ALM）的活动，可选择性地破坏对侧舔食，而同侧舔食则不受影响。我们的研究结果表明，这种丘脑-皮层运动规划过程可由基底节输出所控制。基底神经节皮层在解剖学上处于影响同侧皮层行为的有利位置，单细胞追踪研究描绘了横跨同侧感觉和运动皮层第 1 层的大量投射分支。
多项研究表明，基底神经节对运动回路进行侧向控制，D1 通路激活偏向于对侧运动，而 D2 通路激活偏向于同侧运动。与 D1 通路激活类似，我们发现 SNr 抑制会提高对侧试验的成绩，而降低同侧试验的成绩。我们能够扩展对这种方向性偏向的理解，表明这些变化分别是由于左侧错误方向失败试验的减少和右侧无反应试验的增加造成的（图 2H）。
最近的一系列研究表明，SNr 投射到上丘（黑质通路）与舔食行为的控制有关。在研究中，研究人员对上丘水平的 SNr 投射进行了双侧光遗传激发，这导致小鼠对位于其前方的舔嘴的舔食行为减少，但并未完全抑制。作者还研究了SNr向中脑网状结构（mRF）的投射，这是另一个与舔舐行为控制相关的脑区，但发现在SNr-mRF末端兴奋期间，舔舐活动没有变化。因此，我们的研究结果表明，单侧兴奋SNr近乎完全抑制了舔舐行为，这可以通过向SC的投射来解释。与这一解释相一致的是，解剖追踪实验表明，SNr向SC的投射是双侧的，而向丘脑的投射是同侧的。为什么对SNr的躯体抑制不能促进双侧舔食（与SNr兴奋相反），这需要进一步研究，但可能表明丘脑通路比脊髓通路更容易受到抑制。
一些研究表明，SNr 与其他方面的行为控制有关，包括运动和眼球回转。为了确定我们的操作是否无意中影响了小鼠其他方面的运动，我们记录了小鼠瞳孔和面部的高速视频，并对小鼠进行了部分试验。有趣的是，我们没有观察到任何与光遗传操作相关的运动（包括眼球、胡须和前肢）。这表明，SNr操作后的行为效应可能取决于任务背景或动物的行为状态，例如，在空旷场地奔跑的小鼠，SNr扰动对运动的影响最为明显，而在执行囊状运动任务的动物中，其影响则明显体现在眼球运动上。
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