中枢神经系统中的神经元类型在对损伤或其他损伤的恢复能力方面存在巨大差异。视神经挤压（ONC）会切断视网膜神经节细胞（RGCs）的轴突，导致80%的RGCs在2周内死亡，我们在此研究了小鼠视网膜神经节细胞（RGCs）在视神经挤压后的选择性恢复能力。为了确定与不同恢复能力相关的表达程序，我们首先使用单细胞RNA-seq（scRNA-seq）生成了成人视网膜中46种RGC类型的综合分子图谱。然后，我们追踪了它们在ONC后的存活情况；描述了退化前的转录组、生理和形态变化；并确定了每种类型选择性表达的基因。最后，通过体内功能缺失和功能增益实验，我们发现操纵其中一些基因可以提高神经元的存活率，并改善ONC后的轴突再生。这项研究提供了一个系统的框架，用于解析特定类型对损伤的反应，并证明了差异基因表达可用于揭示干预的分子靶点。
一、简介
中枢神经系统（CNS）受到的损伤，无论是急性（如外伤）还是慢性（如神经退行性疾病），通常都会导致不可逆转的损害。一些神经元会死亡，而存活下来的神经元通常无法长出新的轴突和重建突触连接。这些现象的一个共同但却鲜为人知的特点是，尽管致病因素广泛相同，但特定类型的神经元会受到不成比例的影响。例如，亨廷顿蛋白（HTT）和α-突触核蛋白（SNCA）都广泛表达于神经元中，但亨廷顿蛋白突变导致的亨廷顿氏病以纹状体 GABA 能神经元为主要靶点，而 SNCA 突变导致的帕金森氏病则以基底节多巴胺能神经元为主要靶点。许多其他疾病和损伤也存在类似的不同影响。
我们推断，比较在许多方面相似但在脆弱性方面不同的神经元类型的基因表达模式，可能会找出有助于恢复能力的途径。虽然这种方法很少被使用，但它可以补充比较不同年龄（再生发育神经元与非再生成年神经元）、区域（再生外周神经元与非再生中枢神经元）或物种（再生鱼类神经元与非再生小鼠神经元）的神经元的策略。
为了探索这一策略，我们分析了小鼠视网膜神经节细胞（RGC）对视神经挤压（ONC）的反应，ONC是一种研究已久的创伤性轴突损伤模型。RGC通过视神经发送轴突，将视觉信息传递给大脑中的视网膜感受区（图1A）。ONC穿过RGC轴突，导致80%的RGC在2周内死亡。很少有幸存者能再生轴突，但有一些可以通过各种干预措施促使其再生，不过迄今为止还没有任何一种干预措施被证明能够恢复有用的视力。
图 1 scRNA-seq揭示了成年小鼠中 45 种分子上不同的 RGC 类型
有几个特点使 ONC 成为研究不同易损性的理想模型。(1）所有且唯一的 RGC 轴突都通过视神经，因此损伤是精确控制的、同步的和特异的。(2）存活和死亡的 RGC 共享相同的微环境。(3) 虽然所有 RGC 都有许多共同特征，但小鼠体内的 RGC 有超过 40 种不同类型，每种类型都有不同的形态和生理特征。(4) 最近的研究表明，某些类型的RGC在ONC后存活或再生轴突的能力有所不同。
为了调查RGC类型的恢复能力，我们使用了单细胞RNA-seq（scRNA-seq），我们以前曾将其应用于小鼠和猕猴视网膜。我们首先生成了一个包含 46 种不同分子类型的图谱，然后使用组织学方法将转录组簇与已知和新型 RGC 类型联系起来。以该图谱为基础，我们调查了ONC后6个时间点的恢复能力。我们确定了每种 RGC 类型的损失动力学，发现了巨大的差异，并评估了死亡前的生理和形态变化。然后，我们分析了 RGC 类型之间的表达差异，确定了与复原力或易感性相关的基因。最后，我们使用体内功能缺失和功能增益方法对其中的 10 个基因进行了测试，确定了一些能调节 RGC 存活和/或轴突再生的基因。总之，我们的工作提供了一个全面的成年 RGC 分子图谱，记录了变性前的变化，并证明这种方法可用于鉴定新型神经保护机制。
二、研究结果
2.1 分子定义的 RGC 类型图谱
为了生成RGC类型的分子图谱，我们通过荧光激活细胞分选（FACS）技术从成年（出生后第56天）小鼠体内分离出RGC，并通过基于液滴的scRNA-seq技术对其进行分析。对 35,699 个高质量单细胞转录组的计算分析显示出 45 个分子上截然不同的群组（图 1C），其中一个群组随后被细分（见下文），形成 46 个类型。它们的频率从 0.15% 到 8.4% 不等（图 1D）。所有集群都表达了泛 RGC 标记，如 Slc17a6（编码转运体 VGLUT2）、Rbpms 和三个 Pou4（Brn3）转录因子中的至少一个（图 1E）。根据单个基因的差异表达（DE），一些集群可与先前表征的类型1:1匹配（例如，J-RGCs 的 Jam2和鼻运动偏好开-关方向选择性神经节细胞 [N-ooDSGCs] 的 Mmp17），但对于大多数集群来说，只有两个标记的组合才能赋予它们独特的身份（图 1F）。
由于去核与捕获 RNA 之间相隔 3 小时，我们认为聚类可能受到死后转录的影响。为了验证这种可能性，我们分析了去核后立即用转录阻断剂ActinomycinD（ActD）处理的视网膜中的∼11,800个RGC。虽然观察到了一些差异，如未处理视网膜中即时早期基因（IEGs）的预期上调，但Act处理过的RGC与未处理过的RGC之间的类型频率及其区分标记是相同的（图1G、1H、S1A和S1B）。
聚类在不同的生物重复和计算方法中都具有可重复性（图 S1C-S1F）。此外，我们还比较了视网膜全切片中免疫组化标记的几个 RGC 组的相对频率与它们在 scRNA-seq 数据中的频率，发现两者之间存在惊人的对应关系（图 1I）。这些结果表明我们的图谱是全面的。
2.2 scRNA-seq 簇与形态学定义的 RGC 类型相对应
为了评估分子定义的 RGC 的形态，我们将荧光原位杂交（FISH）和免疫组化（IHC）应用于 RGC 标记稀少的视网膜（YFP-H 线；每个视网膜有 200 个 RGC）。利用一个或少数几个集群表达的基因，我们验证了已知类型的新型标记物，并鉴定了潜在的新型类型。例如，分别特异表达 Gpr88 和 Fam19a4 的新型 RGC 簇 C10 和 C24 的树突在内层丛状层（IPL）的亚层（S）2 和 S4 中分层，而表达 Slc17a7 (Vglut1) 的 C25 的树突只在 S5 中分层（图 2A）。
图 2 scRNA-seq 簇与 RGC 类型的对应关系
2.3 转录组辅助将 RGC 分成亚类
我们和其他人之前定义了几组相关的 RGC 类型，我们称之为亚类。它们包括表达Spp1（骨化素）的αRGCs；分别通过表达转录因子Tbr1和Foxp2定义的T-和F-RGCs；通过生理特性和双层树突定义的ooDSGCs；以及通过表达Opn4（黑素）定义的内在光敏RGCs（ipRGCs）。亚类表现出一些分子上的重叠（例如ON和OFF持续的αRGCs分别表达Opn4和Tbr1），但在很大程度上是不同的。
通过对视网膜进行亚类标记和集群特异性标记的双重标记，我们验证了在每个亚类中区分 RGC 类型的基因组合。对于αRGCs（C41-43、45），4种类型的新型标记物组合比之前通过候选方法发现的类型更具选择性。对于大多数为 Cartpt+ 的 ooDSGCs，我们通过 Mmp17 的表达确定了鼻腔偏爱类型（N-ooDSGC），但只有一个聚类（C16）表达了 Col25a1，这是 D- 和 V-ooDSGCs 的标记。然而，监督分析将该簇与 Calb1 和 Calb2 分成了基本不重叠的细胞，从而使 RGC 类型的总数达到 46 种。仅标记 V-ooDSGCs 的标记线证实，CALB1 阳性的细胞是 D-ooDSGCs，而 CALB2 高的细胞是 V-ooDSGCs（图 2F-2H）。
另一个潜在的亚类是由转基因TYW3定义的，它在几种类型的RGCs中表现出插入位点依赖性表达，这些RGCs在IPL的中间三分之一有共同的树突分层；其中一种被标记为明亮的（W3B），其他则被标记为暗淡的（W3D）（图S2F）。我们通过FACS分离了W3-RGCs，并使用Smart-seq2对它们进行了分析，以获得更深的覆盖范围。在 341 个 RGCs 中，97% 与图谱中的 6 种类型中的一种相匹配： W3B（通过 Sdk2 的高表达确定）、F-mini-ON、F-mini-OFF 和其他三种类型，我们称之为 W3D1-3。剩下的 3%对应于 T-RGC-S2（图 S2G 和 S2H）。有趣的是，所有这些类型都表达了完整膜蛋白 Tusc5/Trarg1（图 2J）。另外两个图谱群 C1 和 C13 在转录上与这些类型接近，并且 Tusc5/Trarg1 阳性；我们称它们为 W3-like (W3L) 1 和 2（图 2J）。这种一致性确定了 9 个类型是我们暂时称为 T5-RGCs 的亚类的成员。它包括 6 种最丰富的 RGC 中的 5 种，约占所有 RGC 的 40%。
这些亚类共占 26/46 种 RGC 类型，每种类型占据的亚类不超过两个。亚类中的类型通常具有密切的分子关系，但并不总是如此： 根据分层聚类分析，4/5 个 T-RGCs (Tbr1+)、4/5 个 F-RGCs (Foxp2+)、5/9 个 T5-RGCs (Tusc5+)、4/5 个 ipRGCs (Opn4+) 和 3/4 个 αRGCs (Spp1+) 是近亲（图 2J）。我们的数据集还根据转录相似性和分子标记鉴定出了一个新的亚类： 8种密切相关的类型共同表达转录因子Neurod2和Satb2（暂时称为N-RGCs；图2J）。这组类型中有 7/8 显然是新类型，它们可能具有共同的细胞特征。剩余的 11/45 个类型由于缺乏与近端集群共享的标记物而没有被归入一个亚类，但它们确实表现出与其他类型的一些耐人寻味的全转录组关系（图 2J）。例如，C10和C24与D/V-ooDSGCs（C16）在转录上接近，并且与已知的ooDSGCs一样，具有S2/S4层叠性（图2A）；它们是时间优先（T）ooDSGC类型的候选者。
2.4 RGC类型对ONC的易感性差异巨大
以成人 RGC 图谱为基础，我们评估了各类型对 ONC 的适应性（图 3A）。为此，我们对ONC后14天（dpc）的8500个RGC进行了分析，此时80%的RGC已经死亡。基因表达中与损伤相关的广泛变化最初限制了我们使用 “一步式 ”监督分类框架对存活的 RGC 进行类型分类的能力（图 3C）。因此，我们制定了另一种方法，利用在 5 个中间时间点收集的 RGC 数据。在这种方法中，每次都重新定义 RGC 类型的转录组特征，以便在下一个时间点分配细胞（图 3B）。这样，我们就能从固有的特异类型特征中分辨出与损伤相关的渐进 “状态 ”变化。然后，我们使用一种结合了监督分类和基于图的投票的混合算法将 RGC 分配到不同类型；我们将这种方法称为迭代-图助推。
图 3 ONC 后 RGC 的 scRNA-seq 图谱分析
接下来，我们根据 RGC 在 14dpc 与对照组相比的频率对其类型进行了排序（图 3E）。存活率从 1% 到 98% 不等。我们将相对频率增加>2倍的7种类型称为 “恢复力”（resRGCs）。由于表面复原力的一些差异可能是由于收集过程中的偏差、特别脆弱细胞的丢失或计算方法的错误分类造成的，因此我们还使用 IHC 评估了所选类型的存活率。在14dpc时，组织学和转录得出的频率与对照组（图1I）一样高度相关（Pearson r = 0.97）。总之，这些数据提供了RGC对损伤的特异类型脆弱性的综合目录。
然后，我们询问 RGC 类型的相对复原力是否与整体分子关系相关。在某些情况下，两者的对应关系非常显著。例如，所有ipRGC（Opn4+）类型都具有恢复力，而所有N-RGC类型都易受攻击（图3F）。然而，其他转录定义的 RGC 分组包含的类型在抗逆性方面差异很大。例如，αRGCs 之前被描述为具有复原力的亚类（Duan 等人，2015 年），其中两个持续类型（C42、43）具有很强的复原力，但两个瞬时类型（C41、45）则相对容易受影响，尽管它们的转录非常接近（图 3F、S5A 和 S5B）。同样，稀有类型和丰富类型都可能具有抗逆性或易受攻击性（图 3G）。因此，转录邻近性和频率并不能完全预测抗逆性。
2.5 损伤后RGC存活的动态变化 定义三个存活组别
在ONC后的前3天，几乎没有RGC死亡，在接下来的5天中，70%的RGC死亡，然后数量逐渐下降，到28dpc时，存活率为10%（图3I和S5F）。根据其损失动力学，我们将 RGC 类型分为三组：7 种抗性类型（占对照组 RGC 的 8.1%）逐渐下降，在 14dpc 时存活率达到 50%；11 种 “中间 ”类型（占对照组 RGC 的 27.2%）在 4 至 7dpc 之间出现显著下降；27 种易感类型（占对照组 RGC 的 64.7%）在 4dpc 时严重减少（图 3J-3M）。因此，中间型和易感型RGC（分别为intRGCs和susRGCs）的存活率在4dpc时差别很大（susRGCs：39% ± 21%；intRGCs：95% ± 25%）。不出所料，这些组别与 14dpc 的存活率排名有很好的相关性（图 S3G）。如上所述，我们使用 IHC 验证了 scRNA-seq 导出的具有不同存活率的 RGC 亚类的存活动力学。
2.6 抗逆性和易感性 RGC 的生理特征
为了确定具有恢复能力的 RGC 是否具有共同的功能特性，我们使用最近开发的体内记录方法监测了单个受伤 RGC 随时间变化的生理特征。简而言之，将携带 32 个电极的柔性网状物注入玻璃体内，在不干扰正常眼球功能的情况下包裹视网膜内层；尖峰分选协议可识别每个电极多达 4 个细胞，并提供波形特征，以便在多个记录过程中对同一细胞进行纵向追踪（图 4A 和 4B）。
图 4 弹性和易感性 RGC 的生理特征
然后，我们对 RGC 进行追踪，以确定有活力和易受影响的细胞群。如果一个细胞的平均发射率至少连续两天下降到 0.5 Hz 以下，我们就将其定义为 “死亡 ”细胞。60% 的 RGC 在 3 到 7dpc 之间死亡，其中 74% 在 14dpc 死亡（图 4E）。相比之下，在未受伤视网膜的2周记录中，<10%的细胞丢失，这表明细胞丢失反映的是与ONC相关的死亡，而不是记录的不稳定性。存活动态反映了组织学上确定的存活动态（图 3I），表明神经元在死亡前并没有长时间的沉默。
我们用这种方法询问存活的 RGC 是否富含特定的反应类型。具有持续反应的 RGC 比具有瞬时反应的 RGC 存活率高出 3 倍（图 4F），这与持续和瞬时 αRGC 的 scRNA 序列结果一致。由于αRGCs在所有RGCs中所占比例小于5%，这一生理结果表明，持续反应与恢复力之间的关系是一种普遍关系。方向选择性 RGC（OSGC）比方向选择性 RGC（DSGC）或非选择性 RGC（NSGC）更易受影响（图 4G）。ON或OFF类型的恢复能力没有差异，但ON-OFF类型更容易受到影响，这与特征选择性无关（图4H）。这种脆弱性与已知的具有瞬时反应的 ooDGCS 的易感性一致，但并没有延伸到其他 DSGCs（图 4I）。这些结果揭示了生理特性与恢复力之间的相关性。
我们的纵向测量还能评估细胞死亡前的生理变化。在测量期间，恢复能力强的 RGC（14dpc 时可检测到的 RGC）的总体发射率变化不大（图 4J）。同样，对于在 3 至 5dpc 期间死亡的 RGCs，其发射率以及方向和方向选择性指数在第 1 至 3 天期间基本没有变化（图 4K 和 4L）。这些结果表明，RGCs 保持着活动水平和突触前输入，这决定了它们的反应特性，直到死亡前不久。
2.7 抗逆性和易感性 RGC 的形态变化
观察发现，RGCs 的功能反应至少可保持到死亡前 48 小时，这就提出了一个问题，即它们的结构完整性是否也同样保持不变。因此，我们跟踪了ONC后3种resRGC类型（ipRGC M2、αRGC OFF-S和αRGC ON-S/ipRGCC M4）和3种susRGC类型（αRGC OFF-T和2种ooDSGC类型）树突形态的变化。我们使用 YFP-H 线进行稀疏标记，并结合 IHC 和树突分层来确定类型（图 S5A-S5C）。
令人震惊的是，resRGCs 在 14dpc 期间保持了稳健的树突形态，树突面积或树轴复杂性没有显著下降（图 4M、4N、S6D 和 S6E）。与功能结果一样，这意味着resRGCs在ONC后仍能保持其完整性。不出所料，到 7dpc 时，susRGC 类型已经很少。但有趣的是，susRGCs在4dpc时仍能保持其树突面积，尽管它们的树突通常比对照组的树突更细、更暗，而且有两种susRGC类型的树突复杂性显著降低（图4O、4P、S6F和S6G）。结合生理测量结果，这种形态学分析提出了一种可能性，即存活的 RGC 有可能在相当长的时间内接受再生疗法。
2.8 ONC 后的全局基因表达变化
为了弄清RGCs的损伤应答程序何时被激活，我们首先描述了ONC后全球调控基因表达的动态变化，确定了771个跨类型广泛共享的时间性DE基因（表S4）。通过 k-means 聚类将基因划分为 8 个模块（Mod1-8）（图 5A），确定了具有不同时间动态的基因集，这些基因集富集于不同的基因本体（GO）生物学过程（表 S5）。例如，模块 1（Mod1）由表达量在 0.5dpc 开始下降的基因组成，富集了与健康神经元功能相关的 GO 术语，如动作电位、突触小泡外排/内吞和轴突逆行运输（图 5B）。与此相反，Mod5 和 Mod6（包括在 2dpc 附近上调的基因）与细胞凋亡和应激途径有关（图 5C）。DE基因几乎没有显示出强烈的类型特异性差异，但ipRGC类型是个明显的例外，其Mod5、6和7基因的上调率大大低于其他类型。
图 5 损伤后基因表达的总体变化
三、研究讨论
我们生成了一个成年小鼠 RGC 类型图谱，并以此为基础追踪特定类型对损伤的反应。我们确定了各类型 RGC 的恢复能力，并记录了退化前的转录组、生理和形态变化。然后，我们选择性地操纵了在恢复能力强或脆弱的类型中表达的基因，发现其中一些基因能在ONC后促进RGC存活和轴突再生。
对35,699个成年RGC转录组的分析发现了45个细胞群。一些证据表明，这些细胞群与细胞类型相对应。(1）类型的数量与最近基于序列切片电子显微镜（≥35）、电活动光学成像（≥32）和新生儿视网膜scRNA-seq的大规模调查相似。(2) 有几个集群可根据先前已知的标记分配到不同类型。(3）对于其他类型，通过与 scRNA-seq 鉴定出的基因进行原位杂交，我们可以将集群归入已知类型，或找到以前未定性分子类型的形态特征。因此，RGC 与视网膜双极细胞一样，成为转录组标准与经典标准定义的类型紧密对应的第二类神经元。这使人们相信，目前最具扩展性的高通量分子剖析方法是对哺乳动物神经系统细胞类型进行分类的可靠方法。
分子图谱提供了有关 RGC 亚类的新见解。首先，对于以前根据形态学、生理学或遗传学标准定义的几个亚类，我们发现了新的成员，如额外的 T-RGC 和 F-RGC。其次，亚类中的成员通常表现出整体转录组学关系。例如，T5-RGC 中的 6 个类型以前曾被证明具有共同的树突层，它们在转录组学上是近似的（5/9 个类型），并且共享 Tusc5 的表达。Neurod2 和 Satb2 在 8 个转录近似类型中共同表达，其中 7 个是新类型。这些类型和其他聚集在已知类型附近的新型类型可能具有共同的细胞特征。另一方面，具有相同功能或结构特征的类型在树枝图上并不总是相邻的（图 2J），特别是当一个类型是多个亚类的成员时。
了解了每种RGC类型的损失动力学后，我们就能确定死亡前几天的分子、形态和生理变化的特征。我们的主要结果是，直到体细胞丧失前不久，这些变化都出奇地温和：RGC 的树突形态、发射率和特征选择性直到死亡前至少 2 天仍接近控制水平。这一观察结果与青光眼模型形成了鲜明对比，后者在死亡前树突的萎缩和功能衰退非常明显。它们似乎还与其他观察到ONC后树突显著萎缩的研究形成了对比；然而，这些研究关注的是更广泛的RGC亚类，因此树突面积的变化可能反映了所检测亚类中RGC类型的存活率不同。
本研究的一个指导性假设是，根据 resRGCs 表达确定的保护性基因如果广泛表达，也会保护其他类型的 RGC。我们对 Ucn 和 Timp2 的这一假设进行了测试，发现它们提高了 CARTPT+ RGC 的存活率，而 CARTPT+ RGC 是最易受 ONC 影响的细胞之一。这一结果支持了我们的方法所发现的靶点可能具有广泛用途的观点。另一方面，这些基因对另一个易感亚类（NEUROD2+）的存活率没有影响，这表明神经保护策略可能需要针对特定的神经元群体。
虽然在1dpc时就能检测到与损伤相关的基因表达变化，但在这一阶段的细胞可通过一步分类器稳健地归入不同类型。然而，在随后的时间里，分类越来越受到状态依赖性变化的影响。
总之，挖掘损伤恢复力和脆弱性的特异性类型分子相关性为介导神经元存活和轴突再生提供了丰富的基因来源。我们发现的一些靶点很可能在其他情况下也有效，而且一般方法很可能适用于中枢神经系统的其他神经元群。
四、研究方法
4.1 方法细节
所有动物实验均已获得哈佛大学和波士顿儿童医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。小鼠在无病原体的设施中按照标准饲养条件饲养，可持续获得食物和水。所有实验均在 6-20 周大的成年小鼠中进行，包括雄性和雌性小鼠。主要分析未考虑性别因素，但我们对给定时间点内样本间 scRNA-Seq 变异的荟萃分析表明，性别特异性差异是最小的因素（图 S3C）。以下小鼠染色用于荧光激活细胞分选（FACS）和组织学研究： Vglut2-ires-cre（Slc17a6tm2(cre)Lowl/J；）与cre依赖性报告基因Thy1-stop-YFP Line#15（B6.Cg-Tg(Thy1-EYFP)15Jrs/J、C57BL/6J（JAX #000664）、TWY3-YFP杂交。以下小鼠品系仅用于组织学研究： Kcng4-cre与 Thy1-stop-YFP Line#1 杂交，Jam-Creer和 Cck-Cre与 Thy1-stop-YFP Line#15 杂交，Pv-Cre（JAX #017320）和 Opn4-Cre与 Rosa-lox 杂交）与 Rosa-lox-STOP-lox-Tomato、YFP-H、B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J（又名 Hb9-GFP）、TWY7-YFP和 Penk-cre （JAX #025112）杂交。在进行 Crispr 诱导的基因敲除实验时，使用 Vglut2-Cre 与 Rosa26-LSL-Cas9 敲除基因（JAX #024857）杂交。
4.2 组织学方法
从心内灌注 15-50 毫升 4% 多聚甲醛（PFA）的动物身上采集眼球，然后再固定 15 分钟，或者从未灌注多聚甲醛的动物身上剥离眼球，然后在 4% PFA 中浸泡固定 30-60 分钟。然后将视网膜用于全片 IHC 或浸泡在 30% 蔗糖中并嵌入组织冷冻介质中冷冻切成 20-25μm 厚的横截面。IHC 切片在蛋白块中孵育 1 小时，一抗孵育过夜，二抗孵育 2-3 小时。初始蛋白块和二抗孵育在室温下进行，一抗孵育在 4°C 下进行。探针生成和 FISH 如前所述进行，但略有改动，特别是减少了蛋白酶 K 的消化量（0.5ug/mL，5 分钟），以保持 GCL 的完整性。在某些情况下，使用市售的 RNAscope 荧光多重检测法进行 FISH 检测，该检测法根据制造商的说明稍作修改（ACDbio）。具体来说，我们排除了在靶标回收液中煮沸玻片的步骤，因为该步骤会破坏 IHC 染色。图 1、图 3 和图 4 中的 IHC 整体装片分析均采用单盲法进行样本鉴定。
4.3 植入网状电极
研究已经报道了视网膜表面网状电极的制作和非同轴植入，但我们实验中制作的网状电子探针带有32个可独立寻址的记录电极，而不是之前报道中的16个电极。将网状电子神经探针装入无菌硼硅毛细管针内，内径：200μm，外径：330μm。使用立体定向台，让装有网状电子神经探针的毛细管针穿过外眦部的预穿刺孔，直至针尖到达视网膜的鼻腔部分，同时特别注意避免损伤晶状体。此前曾有报道称，通过控制网状物电子神经探针的注射来实现精确定位。在注射 2-3 毫米长的网状物并将其置于视网膜表面后，采用传统的同轴注射，同时抽出毛细针，将网状物的外部部分留在眼球外。用少量 Kwik-Sil 硅弹性粘合剂固定网眼探针在外侧眼角的出口。用 3M™Vetbond™Tissue 粘合剂 眼球注射后涂抹抗生素软膏。
4.4 体内记录和刺激方案
我们从注射 ONC 和网状物后的第 1 天开始，每隔一天或两天对 4 只小鼠（共 142 个细胞）进行记录。小鼠被放置在 Tailveiner 抑制器中，固定头板以减少记录时的机械噪音，并在视觉刺激时固定记录眼的视野。FFC 与信号放大器和数字转换器（Intan Technologies, Los Angeles, CA）相连，在计算机屏幕（20.5“ × 12.5”）上向小鼠呈现视觉刺激的同时记录 RGC 活动，计算机屏幕距离小鼠双眼 20 厘米，方位角范围为 ± 52°，与之前报道的方案类似。
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4.5 基于 3′液滴的 scRNA-seq 数据中基因表达的比对和量化
使用 Cell Ranger 软件（2.1.0 版，10X Genomics）将测序读数与小鼠转录组进行解复用和比对。对于每个样本（即 10X 通道/反应），Cell Ranger 会生成一个跨细胞的基因计数矩阵。我们在 “cellranger count”（细胞游侠计数）中使用了“-forcecells 6000 ”选项，特意从数据中提取了更多的细胞条形码，因为我们发现细胞游侠的自动估计过于保守。在这里，6000 个细胞代表了可回收细胞数量的一个 “宽松 ”上限，这个数值是根据生产商的指导原则，根据装载到每个通道上的细胞悬浮液的测量密度计算得出的。
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